1. Что такое колокализация? Предположим, что вам дали коллеги несколько изображений, или у вас есть...
2. Анализ перекрытий на основе объектов
3. Укажите пространственное разрешение явно!
4. Образец набора данных
5. Анализ колокализации с использованием Coloc 2
6. Что такое Колок 2
7. Как использовать Coloc 2
8. Меры предосторожности и примечания
9. дальнейшее чтение
10. Испытание колокализации

Что такое колокализация?

Предположим, что вам дали коллеги несколько изображений, или у вас есть несколько собственных изображений, и вы хотите измерить количество колокализации между двумя красителями или пятнами на изображениях. Сначала вы должны определить, что вы подразумеваете под колокализацией, и это не тривиально. Одно место, чтобы начать читать о колокализации и о том, как правильно получить изображения для количественной флуоресцентной микроскопии, подходящие для колокализационного анализа, смотрите здесь: Курсы обработки изображений в BioDIP, Дрезден , Недавний обзор Данн в 2011 году ,

Методы колокализационного анализа

Анализ пространственной корреляции интенсивности пикселей

Вот только два из многих коэффициентов колокализации, чтобы выразить корреляцию интенсивности колокализующих объектов в каждом компоненте двухцветного изображения:

1. Коэффициент корреляции Пирсона. Он не чувствителен к различиям в средней интенсивности или дальности сигнала или смещению нуля между двумя компонентами. Результат равен +1 для идеальной корреляции, 0 для отсутствия корреляции и -1 для идеальной антикорреляции. Шум делает значение ближе к 0, чем должно быть.
2. Управляет делением коэффициентов. Пропорционально количеству флуоресценции колокализующих пикселей или вокселей в каждом цветовом канале. Вы можете получить более подробную информацию в Мандерс и соавт. Значения варьируются от 0 до 1, выражая долю интенсивности в канале, расположенном в пикселях, где интенсивность выше нуля (или порога) в другом цветовом канале.

Эти коэффициенты измеряют количество или степень колокализации, или, скорее, корреляцию и совместное вхождение соответственно (но не должны быть выражены как значения в%, потому что это не так, как они определены). Но если не с чем их сравнить, что они значат? Costses провел тест статистической значимости, чтобы оценить вероятность того, что измеренное значение корреляции Пирсона, r между двумя цветовыми каналами, значительно больше, чем значения r, которые были бы рассчитаны, если бы было случайное совпадение одной и той же информации. Этот тест выполняется путем случайного скремблирования блоков пикселей (вместо отдельных пикселей, поскольку интенсивность каждого пикселя соотносится с соседними пикселями) в одном изображении, а затем измерения корреляции этого изображения с другим (нешифрованным) изображением. Вы можете получить более подробную информацию в Costes et al. Результаты этих тестов говорят нам, что коэффициенты Пирсона и Мандерса, которые мы измеряем, лучше, чем чистый шанс, или нет.

Другие коэффициенты включают ранговые корреляции, такие как Spearman и Kendal's Tau, Li в ICQ и% интенсивностей или площади (объема) выше одного или обоих пороговых значений (скоро будет Coloc_2). Некоторые другие описаны в литературе, которые использовались в публикациях, но были опровергнуты как нечувствительные, такие как коэффициент перекрытия из бумаги Мандерса, которая J. Adler и соавт. Показано, что есть большие проблемы в интерпретации по сравнению с коэффициентами расщепления Пирсона и Мандерса.

Другие методы включают ICCS (спектроскопию взаимной корреляции изображений) и производную того, что называется PPI (индекс близости белка, оригинальная статья ).

Анализ перекрытий на основе объектов

Эта кулинарная книга не охватывает анализ перекрытия на основе объектов, поскольку она требует сегментирования изображения на объекты и фон, что само по себе является целой ветвью обработки изображений. Увидеть JACoP imageJ плагин для объектно-ориентированных методов.

Укажите пространственное разрешение явно!

Принцип исключения Паули утверждает, что две частицы не могут иметь одинаковые квантовые числа, поэтому они не могут быть в одном месте. Так что на самом деле ничто не является «действительно» колокализованным. С другой стороны, вселенная из одного вокселя (не кубическая, конечно) полностью локализована - все внутри нее. Практически наша ситуация лежит между двумя крайностями. Мы должны локализовать в некотором определенном и явном пространственном масштабе: в нашем случае оптическое разрешение или расстояние между пикселями изображения, в зависимости от того, какое значение больше в нм, микрометрах, мм, метрах, км и т. Д. Измерение колокализации, которое мы проводим, означает только что-либо в отношении в пространственном масштабе, над которым мы работаем, так что это должно быть четко указано. Вы можете найти более подробную информацию об оптическом разрешении и расстоянии между пикселями изображения в следующих разделах.

Слишком часто составные / объединенные изображения красного и зеленого каналов считаются достаточными для демонстрации колокализации. Это совершенно неправильно. Помимо проблем с слияниями красного / зеленого изображений для дальтоников, существует еще одна очень веская причина требовать точечных графиков: восприятие человеческого глаза и мозга можно очень легко одурачить. Просто посмотрите на это изображение:

Большинство людей могут подумать, что изображение содержит 4 различных цвета: 2 набора тонких спиралей темно-красного и темно-зеленого цвета и 2 толстых выступающих спирали желто-зеленого и желтого цвета. Однако желтый и желто-зеленый на самом деле имеют абсолютно одинаковый цвет! Вы можете убедиться в этом сами, позвонив в Файл ▶ Открыть образцы ▶ Спирали (Макро) на Фиджи.

Вот еще один. Два круга выглядят как разные цвета, но они абсолютно одинаковы, если вы измеряете значения пикселей.

Итак ... как вы относитесь к определению колокализации при поиске желтых капель? Не имеет особого смысла, не так ли? Мы замечаем, что оттенки и оттенки цветов выглядят по-разному в зависимости от того, с какими другими цветами они рядом! Таким образом, вам нужно измерить что-то из значений пикселей, а не просто субъективно «посмотреть» на изображение слияния красного / зеленого цвета.

Еще лучшая причина всегда смотреть на диаграммы рассеяния / 2D гистограммы / цитофлуорограммы - это то, что они действительно показывают то, что вы ищете и о чем говорите - корреляцию (или нет) между интенсивностями двух цветовых каналов пикселей в пространстве.

На диаграмме рассеяния или 2D-гистограмме (спасибо Тони Коллинзу за эту прекрасную фигуру) два значения интенсивности для каждого пикселя или вокселя нанесены друг на друга, и чем ярче цвет, тем больше пикселей или вокселей имеют эти два значения интенсивности для их двух цветов каналы. Здесь мы видим, есть ли корреляция сразу на глаз, при наличии облака информации в середине 2D гистограммы. Мы можем приспособить это облако к линейной регрессии и измерить коэффициенты корреляции.

После установки пороговых значений в обоих цветовых каналах мы видим, что диаграмма рассеяния или 2D-гистограмма разделена на 4 области - квадранты. Содержимое каждого из них может быть использовано для расчета различных результатов колкокализации.

Образец набора данных

Давайте откроем образец набора данных, который, как мы знаем, должен иметь очень хорошую колокализацию, потому что 2 субъединицы димерного белка окрашены зеленым и красным красителями соответственно. Методы Пирсона, Мандерса, Костеса и Ли должны очень хорошо работать для этого образца, но, может быть, мы можем увидеть некоторые проблемы с данными? Может быть, мы можем решить, подходят ли данные для этого анализа или нет?

Откройте этот пример файла данных colocsample1bRGB_BG.tif , Затем используйте команду меню «Image-Color-Split Channels», чтобы получить отдельный стек z для 2 красителей (вы можете выбросить синий!).

При желании вы можете изменить таблицы просмотра изображений (LUT), чтобы один из них был «зеленым», а другой - «пурпурным». Конечно, цвета здесь всегда ложные. Эти ложные цвета полезны только для определения, какой канал какой. Оптоэлектронные детекторы, которые мы используем, видят только фотоны и не знают, какого они цвета; это определяется используемыми нами фильтрами флуоресцентного излучения. Не существует такого понятия, как зеленый или красный краситель, поскольку они имеют широкий спектр излучения, а не одна длина волны, соответствующая определенному «цвету». Если я хочу показать DAPI зеленым, а EGFP - пурпурным, в этом нет ничего «неправильного».

Анализ колокализации с использованием Coloc 2

Coloc 2 реализует и выполняет корреляцию интенсивности пикселей по космическим методам Pearson , Manders , Costes , Li и более, для диаграмм рассеяния, анализа, автоматического определения пороговых значений и тестирования статистической значимости.

Ничто из этого не дает ощутимых результатов, если вы правильно не настроили свое оборудование для обработки изображений и не получили изображения должным образом, а также не выполнили соответствующие настройки для просвечивания и хроматического сдвига и т. Д. См. здесь для аппаратных рекомендаций по настройке ,

Этот плагин заменяет Порог колокализации а также Испытание колокализации плагины, которые, к сожалению, были глючными и сложными в обслуживании. Итак, мы начали с нуля с тщательно спланированного и разработанного нового плагина. Хотя старые плагины также описаны ниже, мы рекомендуем использовать Coloc 2.

Что такое Колок 2

Coloc 2 - это плагин, который использует новую библиотеку контейнеров данных изображений ImgLib для обработки изображений и реализует описанные выше методы независимым, модульным и легко расширяемым способом с типом данных пикселей (8, 16, 32-разрядный). Исходный код имеет модульные тесты, чтобы определить, не нарушают ли математические изменения в исходном коде. Должно быть легко добавлять новые методы, так как плагин разработан с учетом этого.

Одной из основных особенностей Coloc 2 является стандартизированный вывод PDF, который предназначен для сопоставимости результатов различных экспериментов по колокализации.

Как использовать Coloc 2

Пожалуйста, посмотрите Coloc2 страница для получения полных инструкций по использованию плагина Coloc 2, включая распространенные ошибки методов пространственной корреляции интенсивности пикселей, которые он использует.

Меры предосторожности и примечания

Проверьте данные изображения на наличие проблем и пригодность для анализа

Вопросы, которые вы должны задать, прежде чем пытаться анализировать колокализацию из двух изображений цветовых каналов, используя методы пространственной корреляции интенсивности пикселей в Manders и Costes:

1. Являются ли данные изображения шумными?
2. Было ли сжатие с потерями?
3. Информация об интенсивности насыщена / обрезана / переэкспонирована?
4. Есть ли проблема с равномерным смещением фона / детектора?
5. Каково пространственное разрешение?

Для начала нам следует проверить изображения на наличие проблем, которые могут привести к сбою или ненадежности методов анализа колокализации.

1. Значительный шум (неопределенность в значениях пикселей - обычно из-за обнаружения слишком малого количества фотонов) означает, что методы, которые мы будем использовать, будут значительно недооценивать истинную колокализацию или даже полностью не дадут «правильный» результат.
2. Сжатие с потерями портит информацию об интенсивности пикселей, в результате чего результат колокализации будет более или менее неправильным.
3. Интенсивность отсечения / насыщения - это плохие новости. Измерения корреляции интенсивности пикселей основаны на истинности интенсивности пикселей и не ограничены до 255, когда они были действительно выше! Увидеть Обнаружить потерю информации учебник для деталей о том, как обнаружить такие проблемы.
4. Мы должны искать неправильное смещение / высокий фон (так как это путает метод автоматического порога, так как нулевой сигнал - это не нулевая интенсивность пикселей, а некоторое большее число)
5. Пространственное разрешение

Пространственное разрешение изображений по определению определяет пространственное разрешение, при котором вы измеряете колокализацию. Результаты будут отличаться на разных уровнях пространственного разрешения. Если изображение - один большой пиксель, все будет колокализовано!

Пространственное разрешение светового микроскопа ограничено длиной волны света (и NA объектива) в соответствии с работой Эрнста Аббе. Молекулы / белки на порядок меньше длины волны видимого света, поэтому они могут быть на расстоянии многих нм, но при этом они отображаются в том же пикселе изображения. Это настоящая колокализация? Возможно, но это зависит от того, как вы это определяете!

Изображения пространственно откалиброваны? Если нет, то нам нужно откалибровать их, чтобы мы знали пространственную частоту дискретизации (например, размер пикселя или вокселя) по x, y и z. Увидеть SpatialCalibration учебник о том, как это сделать. Нам нужно, чтобы изображения были пространственно откалиброваны, чтобы метод статистической значимости Костеса (см. Ниже) работал правильно.

Нам нужно тщательно продумать правильное или адекватное пространственное разрешение по x, y и, возможно, z. Это зависит от Числовая апертура объектива. Вы можете рассчитать правильные размеры в пикселях или вокселях для объектива, который вы используете, чтобы получить максимальное разрешение, которое этот объектив может реально видеть: Калькулятор Найквиста ]. По существу, пиксели / воксели должны быть примерно в 3 раза меньше, чем разрешение объектива. С другой стороны, если вас интересуют только более крупные объекты, а не мельчайшие детали, которые может видеть объект, имеет смысл иметь пиксели или воксели большего размера. Опять же, они должны быть примерно в 3 раза меньше самой маленькой функции, которую вы хотите разрешить.

Никвист говорит нам, что пространственная выборка должна быть примерно в три раза меньше самого маленького объекта, который мы хотим разрешить. Помните, что корреляционный анализ пространственной интенсивности, как мы здесь выполним, не может сказать вам, что 2 белка связаны друг с другом в некотором биофизическом взаимодействии. Однако можно предположить, что эти 2 молекулы встречаются с одинаковыми относительными количествами, когда они присутствуют в наборе пространственных выборок (пикселей или вокселей) с интенсивностями выше порогов, которые мы рассчитаем ниже. В любом случае, это может быть намек на то, что «возможно, они являются связывающими партнерами или находятся в одном макромолекулярном комплексе». Вы должны следить за тем, чтобы определить истинную привязку, используя FLIM , FRET и биохимические методы, такие как Иммуно-совместное осаждение и т. д.

дальнейшее чтение

Старые плагины колокализации

Порог колокализации

Примечание: этот плагин больше не находится в стадии активной разработки и поддержки. использование Колок 2 вместо этого, который делает то же самое, только лучше.

Порог колокализации Плагин выполняет несколько функций для вас за один раз. С "зелеными" и "красными" стеками colocsample1bRGB_BG.tif Набор данных открыт и каналы разделены (см. выше), выберите пункт меню «Анализ-Колокализация-Колокализация Порог». Затем выберите правильные стеки для анализа в Channel1 и Channel2. При желании вы можете использовать область интереса (ROI), которая должна быть определена до запуска плагина. Установите флажки «Показать колокализованные пиксели» и «Показать диаграмму рассеяния» (см. Также Зачем разбрасывать участки? ) и другие выключены. Вы можете изучить параметры в настройках параметров. Включите ВСЕ параметры при первом использовании, чтобы увидеть, на что они способны.

<\ P>

1. Он генерирует 2D гистограмму / диаграмму рассеяния / флюорограмму. это действительно хороший способ визуализировать корреляцию интенсивности пикселей по всем пикселям / вокселям в изображении, и он может сразу же сообщить вам о таких проблемах, как насыщение / ограничение интенсивности, неправильное смещение, прохождение излучения (сигнал флуоресценции от неправильного красителя) в канале обнаружения), и даже если в одном и том же образце есть несколько популяций колокализующих видов с разными соотношениями красителей. Думайте об этом как о диаграмме рассеяния FACS или проточной цитометрии; на самом деле это очень похоже.
2. Это делает линейное регрессионное соответствие данных на графике рассеяния. Это диагональная белая линия на диаграмме рассеяния, градиент которой представляет собой отношение интенсивностей двух каналов.
3. Это делает автоматическое определение порога метода Костеса. Пороговые значения представляют собой уровни интенсивности, выше которых для обоих каналов вы говорите, что два красителя "колокализованы". Этот метод использует итерационную процедуру, чтобы определить, какая пара пороговых значений для 2 каналов диаграммы рассеяния дает Коэффициент корреляции Пирсона (r) нуля для пикселей ниже порогов. Это означает, что все пиксели, которые имеют интенсивность выше двух пороговых значений, имеют корреляцию больше нуля, а пиксели ниже пороговых значений не имеют или не имеют коррелированных интенсивностей. Этот метод достаточно надежен (при условии, что вы его не победите тупо, т. Е. С данными изображения с высоким смещением / фоном) и полностью воспроизводим, что означает, что вы всегда получите одинаковые пороги для одного и того же набора данных и аналогичные пороги для похожих наборов данных. Установка порога является большой проблемой в анализе колокализации. Если вы используете инструмент, который позволяет вам вручную устанавливать пороговые значения, очевидно, что вы можете получить любой результат, который вам нравится, так как вы субъективно решаете, что является колокализованным, а что нет. Это может понравиться вашему боссу, но это не очень научно, не так ли? Так что не делай этого! Вместо этого используйте автоматический порог Costes! Некоторые люди говорят, что метод Costes устанавливает пороги слишком низкими и ниже, чем они бы устанавливали на глаз. Это может быть правдой, но ручные методы субъективны и абсолютно ненадежны. Пороги, которые устанавливает метод Костеса, всегда означают, что корреляция ниже порогов равна нулю. Это хорошая вещь.
4. Плагин наконец отправляет кучу статистики и результатов в окно результатов. Вам необходимо включить их все, используя флажок «set options» в GUI плагина. Некоторые из этих результатов довольно неинформативны. Они перечислены здесь, в порядке их полезности:
   1. Разделенные коэффициенты колокализации Мандера с пороговым значением (ноль не означает колокализацию, один означает идеальную колокализацию. Существует один коэффициент на канал, который сообщает вам долю сигнала в этих каналах, которая колокализуется с другим каналом. Конечно, это может отличаться для двух каналы! Коэффициенты порогового значения Мандера - это, вероятно, числа, которые вы бы опубликовали (не коэффициенты Пирсона, поскольку они менее информативны).
   2. Пороги, которые были установлены методом порога Costes Auto.
   3. Коэффициенты Пирсона для: целого изображения, изображения выше пороговых значений (должно быть близко к 1 для очень хороших колокализующих красителей) и изображения ниже пороговых значений (должно быть около нуля, потому что именно так пытается установить их метод автоматического порога Costes ... так если не близко к нулю, что-то пошло не так!)
   4. Решение по линейной регрессии: если данные изображения близки к идеальным, со сравнимой средней интенсивностью в обоих каналах и нет проблем со смещением / фоном, то по определению градиент линии регрессии будет близок к единице (1), а точка пересечения будет близко к нулю. Обе эти вещи хороши для качества результата. Эта информация может быть менее полезной в других ситуациях, например, когда в одном канале имеются только редкие данные или имеется несколько колокализующих групп сигналов (несколько четко независимых участков / пятен на диаграмме рассеяния).
   5. Колокализованные значения% объема и интенсивности довольно бесполезны, если только вы не используете биологически релевантную область интереса, так как они очень зависят от того, сколько материала и фон есть на определенном изображении, и вы получите совершенно разные значения для разных изображения одного и того же образца, имеющие разные области фона. На изображениях, которые не имеют пустых областей, таких как образцы тканей, это может быть полезным числом. Может быть,% интенсивность выше пороговой колокализованной может быть полезным значением в некоторых случаях? Смотрите раздел 6.3 на http://www.uhnresearch.ca/facilities/wcif/imagej/colour_analysis.htm для более подробного объяснения того, что конкретно представляют собой различные измерения, или посмотрите код.

   Испытание колокализации

   Примечание. Этот плагин больше не разрабатывается и не поддерживается. использование Колок 2 вместо этого, который делает то же самое, только более правильно и как описано в оригинальной публикации Costes, вместо того, чтобы делать неприятные предположения и сокращения.

   Испытание колокализации Плагин выполняет тест Costes для статистической значимости (что вы должны ВСЕГДА делать после вычисления пороговых коэффициентов Manders и диаграммы рассеяния). Он находится в меню « Анализ» ▶ «Колокализация» ▶ «Тест на колокализацию»

   

   Выберите правильные стеки изображений каналов 1 и 2 из выпадающих списков. Убедитесь, что «Только текущий фрагмент» выключен, а «Сохранить пример случайного изображения» и Показать все значения R »включены. Затем нажмите« ОК »

   

   Затем в окне результатов отобразится рассчитанное значение P и некоторые другие подробности расчета теста.

   

   Метод Костеса для Статистическая значимость опирается на пространственную калибровку изображения, знание Числовая Апертура (NA) объектива и длины волны флуоресцентного излучения для расчета количества пикселей функция разброса точек обложки на изображении. Затем он берет изображение в одном из каналов и рандомизирует его, перемещая куски изображения размера PSF в случайные места в новом случайном тестовом изображении. Затем он рассчитывает Коэффициент корреляции Пирсона (r) между рандомизированным изображением и исходным изображением другого канала. Если корреляция рандомизированного изображения с реальным изображением другого канала так же хороша или лучше, чем корреляция между двумя реальными изображениями, то любая измеренная вами корреляция не лучше, чем та, которую вы случайно получили бы для этого изображения , Этот тест выполняется много раз (100) раз, и выводится значение P, которое представляет собой долю случайных изображений, которые имели лучшую корреляцию, чем реальное изображение. Значение P, равное 1,00, означает, что ни одно из рандомизированных изображений не имело лучшей корреляции. 0,95 является нормальным статистическим доверительным интервалом 95%. Все, что ниже этого, и корреляция / колокализация, которую вы измеряете на реальных изображениях, вряд ли будут лучше случайного шанса и, следовательно, вероятно, не будут интересны.

   В этом случае значение P должно быть 1,00. Поскольку вы сказали, чтобы отображались значения корреляции (r) Пирсона (значения R здесь), они находятся в другом окне. Вы можете видеть, что все они близки к нулю, и в результате вы можете видеть, что в среднем рандомизированное значение R составляет около нуля, что означает, что все рандомизированные изображения не имеют корреляции с реальным изображением. Что хорошо!

   Другие доступные методы, такие как Fay и Van Steensel, делают то же самое, но рандомизируют изображение менее строгими, но очень простыми способами, которые могут привести к ошибкам, таким как завышение или занижение P-значения. Однако они работают быстрее, чем метод Коста.

   Опять же, что касается Порог колокализации плагин, использование ROI здесь вполне может иметь смысл, так как вас интересует только корреляция между двумя цветовыми каналами в тех частях изображения, где находится интересующая вас биология. Фон его обычно неинтересен, и вы можете исключить его из анализа. Вероятно, разумно использовать тот же ROI, который вы использовали в Порог колокализации плагин!